Dictionnaire des milieux de culture DIY

Peptone :
hydrolysat

La caséine du lait a été partiellement digérée par des protéases, tel que la papaïne (sève de papaye), ou la bromaléine.

Caco3 : Craie

Acide citrique : Magasin de bricolage

Acide phosphorique : Magasine de bricolage

NaOH : Soude caustique

Extrait de levure : Rayon diététique

Na2HPO4 : mélanger NaOH+HPO4 === NaOH + H3PO4 = Na2HPO4 + H2O (attention, production de chaleur)

Bonjour,

Une traduction  d’ article sur les milieux de cultures fait maison :

Milieux fait maison  pour l’amateur en  microbiologie

 

Traduction de l’Article de Cathal Garvey

(cathalgarvey@gmail.com)

Introduction :

Le milieu de culture bactérienne est un élément essentielle pour l’isolement et la culture de microbes. Le choix correcte et l’utilisation des milieux permet de sélectionner les espèces désirées, de contrôler et d’influencer leur croissance et leur comportement, de révéler beaucoup de choses sur leur métabolisme.
La première décision d’un microbiologiste avant  la culture de bactéries est de savoir quel milieu il va utiliser car les résultats varient énormément en fonction du milieu.
Toutefois, pour le biologiste amateur, l’exigence de milieux de croissance stériles et appropriée peut être rebutant ou intimidant. Il ne devrait pas l’être!
Ici, j’ai l’intention d’exposer la façon dont vous pouvez faire vos propre milieux de croissance en utilisant uniquement des ingrédients faciles à obtenir.
La marche à suivre est très voisine de celle de la préparation d’un repas.
La seule partie de cette procédure qui pourrait être différente de ce que vous auriez normalement à faire pendant la préparation d’un repas est la nécessité de stérilisation par cuisson sous pression (autoclavage), qui est par contre une méthode déjà utilisée dans les cuisines du monde entier.
Si vous ne savez pas comment utiliser un autocuiseur, demandez une démonstration à quelqu’un qui sait le faire.
NB: Ne jamais sceller des pots ou bouteilles avant l’autoclavage.

Alors, pourquoi cela semble-t-il si difficile ?
Les bactéries sont souvent accusées de pousser partout,il semble évident que créer quelque chose pour encourager leur croissance est chose aisée. Dans la réalité, c’est vrai.
Certains types de bactéries se développeront dans presque tous les milieux que vous préparez. C’est  précisément, la raison pour laquelle il est justement si difficile de prévenir la contamination, et de sélectionner le type de bactéries que vous voulez.

Le plus simple type de milieu bactérien serait probablement composé d’un bouillon de nourriture bouillie et d’un peu sucre.
En fait, ce milieu est décrit plus bas comme “pomme de terre dextrose agar / Bouillon (PDA)”.
Ce type de support fournit beaucoup d’éléments nutritifs pour les bactéries, les acides aminés, des vitamines et des sels minéraux, etc , tandis que le sucre est la “source de carbone”, qui donne de l’énergie aux bactéries et des atomes de carbone  nécessaires pour créer des molécules complexes nécessaires à la croissance.

Toutefois, la nécessité de stériliser nos milieux avant de les utiliser (vous, vous voulez faire pousser uniquement les bactéries de votre choix), implique quelques changements dans le choix de nos ingrédients, ex : le sucre en poudre ne peut pas subir l’autoclavage prolongé (pression et la cuisson) à cause de la caramélisation.

Ainsi, des solutions de rechange sont utilisées lorsque cela est possible, voir, le glycérol.

La même chose peut être vrai pour certains autres composants de votre bouillon.
Dans certains cas, nous aurons besoin de quelque chose d’un peu plus standardisé que “le bouillon cuit et le sucre”, parce que si vous développez quelque chose d’intéressant ou qu’une culture particulière pousse joyeusement dans votre milieu, vous pouvez souhaiter partager vos résultats avec quelqu’un d’autre d’une manière qui fait sens.

Pour cette raison, des protéines purifiés et partiellement digérées (appelé “Tryptone” ou “Peptone”) et extrait de levure sont des normes habituellement utilisées.
Un moyen facile de faire de la Tryptone DIY sera présentée plus tard.
Voici  quelques milieux qui peuvent être utilisés pour des expériences de croissance intéressantes ..

Bouillon Lysogénique (milieu LB ‘Lysogeny broth’ )

Le milieu le plus populaire utilisé dans les laboratoires d’aujourd’hui est appelé Bouillon lysogénie, ou de bouillon LB. Quand il est gélatinisés avec de l’Agar.

Il permet de faire des milieux solides , il est alors appelé Agar LB. Il s’agit d’un milieu de croissance idéal pour les entérobactéries comme E. coli, et suffisamment simple pour permettre de préparer des variantes  faciles.

Un exemple pertinent est l’ajout d’antibiotiques (ne pas rejeter dans la nature, ou dans le systéme d’eau usées) ou de toxines afin de tester la résistance des bactéries.

Bouillon LB est composé des éléments suivants:
1L d’eau désionisée / Eau distillée (vous pouvez utiliser de l’eau embouteillée)
10g Tryptone * – Comme une source de carbone, et aussi pour l’énergie. Nous évite l’ajout de sucres.
Extrait de levure 5g ** – Pour les vitamines, les minéraux et les acides nucléiques.
Chlorure de sodium 10g (sel de table)
[Agar 15g si désiré] – Seulement nécessaire à la fabrication des plaques de gélose.
Hydroxyde de sodium (AKA Lye / soude caustique) pour faire pH 7,5
.

MILIEU pour bactéries bioluminescentes

Ce milieu peut être utilisé pour isoler et  cultiver des bactéries marines bioluminescentes prélévé sur du poisson frais, des crevettes ou des calmars (ou en prélevant directement à partir d’eau de mer, parfois).
Le milieu est assez salé, donc la plupart des bactéries non marines poussent mal dessus.
Il exige plus de glycérol comme source d’énergie: le glycerol  est facilement digestible par les bactéries et permet  d’encourager vigoureusement la production de lumière,
certaines bactéries pourraient ne pas être en mesure de se développer sur Tryptone seuls.
Le bouillon pour Bioluminescence est composé des éléments suivants:

Glycérol 3ml
5g Tryptone *
5g extrait de levure **
1g *** carbonate de calcium
35g *** de chlorure de sodium
[Agar 15g]
* Tryptone est une protéine partiellement digéré. Nous allons expliquer comment en préparer un peu plus tard!
*** Les deux d’entre eux sont utilisés pour rendre le milieu plus alcalin, et sont probablement interchangeables!
Milieu Pomme de terre Dextrose (Bouillon / Agar) (Abbv. APB / PDA)

Ce milieu simple est utilisé pour cultiver des bactéries ou des moisissures (champignons et levures ou) qui attaquent les plantes dans le sol.

Important, pour le dextrose, le temps de stérilisation après que la bonne pression soit atteinte est atteinte ne doit pas dépasser 15 minutes (autoclavage).

Vous pouvez utiliser un PDA pour développer des levures couramment utilisés dans la cuisine, peut-être pour cultiver vos propres souches ou pour tester la viabilité de votre levure avant la cuisson d’un gâteau important ;) .

Ou peut-être, vous souhaitez créer vos bouillons de levure afin de réaliser vos propres extrait de levure!

Bouillon PDA est composé des éléments suivants:
Infusion de pommes de terre 200g (Faire bouillir les pommes de terre brossées / tranché pendant 30 minutes et filtrer les matières solides).

Agar 20g

20g de dextrose

Ingrédients ou additifs difficiles ou portés disparus

Comment pouvons-nous éviter la complexité ajoutée par des ingrédients comme le carbonate de calcium, l’hydroxyde de sodium et le tryptone?

En cas de doute, Google peut fournir des réponses.

Carbonate de calcium :

Le carbonate de calcium est utilisé sous forme de comprimés antiacides populaires comme Rennie, formant la partie la plus importante d’un comprimé. Si vous pouvez en trouver un qui soit uniquement composé de carbonate de calcium, tant mieux! Il

Evitez une composition avec des sucres ou n’importe quoi d’autre que les sels de calcium.

Sulfate de magnésium :

Un autre est le sulfate de magnésium, ou MgSO4 .. aussi
connu sous le nom de sel d’Epsom.

Vous pouvez obtenir ceci via les sels de bain, ou en allant chez d’un pharmacien. Cherchez-le pur.

Extrait de levure :

Pour l’extrait de levure c’est facile, il est couramment vendu dans les magasins au rayon diététique, mais la teneur en sel peut être gênant pour nos usages. Regardez dans les rayons santé-alimentaires pour des extraits sans sel ajouté.

Hydroxide de sodium  :

Hydroxyde de sodium, AKA Lye, AKA la soude caustique, est disponible comme un produit chimique cuisine. Cherchez le produit qui énumère les ingrédients, afin que vous puissiez obtenir la plus grande concentration d’hydroxyde de sodium possible. Assurez-vous que les d’autres additifs sont des choses que vous connaissez et comprenez. Vous pouvez également utiliser du carbonate de calcium à la place, les deux sontutilisée comme tampons alcalins.

Si vous utilisez l’hydroxyde de sodium, ajouter le et dissolvez le dans l’eau lentement. Comme c’est une base forte, il va réchauffer rapidement donc ATTENTION.

Si vous pouvez obtenir une formule de travail à l’aide de calcium, c’est mieux car c’est beaucoup plus sûr!

Pour le tryptone c’est la plus délicat, car il n’y a probablement pas de remplacement ‘hors-the-shelf’ du mélange “peptides digérés/acides aminés”.

Heureusement, avec quelques ingrédients facilement disponibles, vous
pouvez faire votre propre tryptone à l’aide de protéine de soja et d’attendrisseur de viande ou de comprimés qui aide à la digestion ( ex:comprimé à la papaïne,ou bromaléine) !

“Tryptone” fait maison :

Le Tryptone est juste fait de protéines de lait (caséine, pour être exact), digéré par la trypsine, une enzyme digestive trouvée dans l’estomac. Avant que vous courriez à sa recherche, sachez que la trypsine n’est pas normalement disponible dans les magasins.
Toutefois, la trypsine est juste une protéase, une enzyme qui digère toute autre protéine à un endroit spécifique le long de la molécule. Il ya plusieurs protéases qui sont couramment utilisés dans les cuisines.
Poudres à base d’attendrisseur de viande, par exemple qui sont généralement faites à base de bromélaïne, qui est dérivée de l’ananas. Les comprimés pour l’aide à la digestion contiennent souvent beaucoup de bromélaïne ou des composés de fonction semblable.

La caséine devraient être disponibles sous forme de protéines pures dans certains magasins de gonflette.Toutefois, des traces de lactose peuvent subsister dans ces poudres, ce qui pourrait nuire un jour si vous souhaitez utiliser le promoteur LacZ dans vos constructions pour controler l’induction d’un géne étranger.

Il peut être donc être préférable d’utiliser une protéine différente. Voici une recette en utilisant 100% de soja
Sinon, pas d’inquiétude.

Exemple d’alternative :

Isolat de protéine de soja pour faire phytone, un analogue proche du tryptone. Cela devrait être adapté à tous les applications; BD Biosciences par exemple commercialise une peptone de soja, qui prend en charge toutes sortes de microbes.

Phytone – Peptone à base de soja
Isolat protéique de soja 50g
Eau déminéralisée ou minérale 500ml
La bromélaïine (ou attendrisseur de viande), 1000 GDUs ou une dose généreuse de poudre (2 grosses cuillères)

Dissoudre la protéine de soja entièrement dans l’eau, puis chauffer le bouillon résultant jusqu’à ce que ça mijote. Abaisser la chaleur, mais gardez très chaud pendant 5 minutes. Cela peut aider à dégrader les inhibiteurs de la protéase qui pourraient être cachés dans votre protéine de soja, ce qui empêcherait la bromélaïne de faire son travail. Nous allons ajouter tellement de bromélaïne que cela pourrait ne pas avoir d’importance, mais tout aide est bonne à prendre. La cuisson de la protéine aidera également, la cuisson aide à pré-dégrader la protéine, ce qui peut aider le bromélaine à digérer les protéines.

Laissez le mélange refroidir jusqu’à ce qu’il soit légèrement chaud au toucher. 45°C devrait être idéal pour la digestion, mais ne vous inquiétez pas trop. La bromélaïne a une étendue de pH et de température assez large dans lequel il peut travailler.

Remuez de temps en temps pendant environ 20 minutes.

Puis laisser mijoter pendant 5 minutes pour désactiver la bromélaïne.
Vous pouvez laisser mijoter la protéine pour réduire ou même faire sécher, mais vous pouvez aussi l’utiliser directement.

Réaliser un milieu de culture pour Bactéries Bioluminescentes

Voici un guide pour réaliser le milieu Bioluminescent

Etape 1:

Récupérez vos ingrédients, vérifiez les quantités dont vous aurez besoin pour la recette, et vérifiez que vous en avez assez. Planifiez et notez les quantités que vous aurez besoin pour le volume que vous
avez besoin / envie. Assurez-vous que vous avez les outils nécessaire: cuillères, un gobelet mesureur, une balance aussi précise que possible, un mélangeur, et un autocuiseur.
Cerveau, optionnel mais recommandé.

Etape 2:

La poudre de soja (voir phytone), mesure souhaitée pour la solution finale
mélange moyen (5g / L), dissoudre dans 1/4 finale
du volume d’eau pour dilution, eau en bouteille / distillée / désionisée.
Mélanger avec la bromaléine.

Laissez mijoter pour neutraliser les inhibiteurs de la protéase.
Refroidir à 40°C-45°C, pour la dissolution par la Bromelaine. Maintenir à environ 45°C pendant 20 minutes, en remuant
de temps en temps. Puis laisser mijoter pendant
5-10 minutes pour détruire les enzymes.

Étape 3:

Mesurer et dissoudre les sels dans un autre 1/4 volume d’eau (¼ de litre).
Pour 1 litre de bouillon de milieu luminescent, nous voulons 35g de
Chlorure de sodium (sel de mer) et Carbonate de calcium 1g. Notez que «sels» est un terme général pour des composés ioniques dissous, il ne signifie pas nécessairement le sel de table.Deux comprimés antacides par exemple si chaque comprimé contient environ 500 mg de carbonate de calcium, et que nous en voulons 1g..

Étape 4:

Prenez 5g d’extrait de levure pour le milieu pour bactéries bioluminescentes.
Dissoudre ceci dans un peu d’eau bouillante
pour le rendre soluble dans le reste du milieu.

Étape 5 :

Ajouter Glycérine 3ml / glycérol et la levure Extrait de l’autre  volume 1/4 d’eau. Vous n’aurez probablement pas de la glycérine à 100%, en pharmacie, on peut obtenir de la glycérine 30% avec seulement une trace d’anis. Je suis sûr que les bactéries ne m’en voudrons surtout pas du goût d’anis (glycérine pour maux de gorge). Toutefois, notez que cette dilution de 30% signifie que pour obtenir 3ml de glycérol, je vais avoir besoin de 10ml de ce genre de chose.

Étape 6:

Mélanger le tout.
Mettez les trois volumes que vous avez préparés dans un mélangeur, et ajouter suffisamment d’eau pour faire de votre volume total. Dans cet exemple, je fais un litre .

Etape 7: (en option)

Ajouter l’agar.
Je pourrais vouloir isoler des colonies en culture grâce au bouillon.

Donc, je me suis réservé environ 200 ml du milieu de base, et a ajouté une quantité proportionnelle d’agar selon la recette, et même un peu plus (il vaut mieux être un peu trop dur que trop mou).
Mélanger le tout et mettez au micro-onde.
Etape 8:

Versez dans des boîtes de pétri (voir méthode sur Google), sur un espace de travail stérile (par exemple près d’un bec Bunsen ou sous une hotte à flux). Bientôt, la partie sur l’autoclavage et les zones stériles va être publié.

Paru dans le cadre d’un Partage des Conditions Initiales Creative, Commons License Sharealike. Cela signifie que vous avez le droit de copier, partager et même remanier ce travail sans demander l’autorisation préalable de l’auteur, à condition de citer l’auteur  de l’article originale et de soumettre la nouvelle version sous la même licence.
Détails disponibles ici: http://www.creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0

 

Advertisements

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s